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metadata.dc.type: Dissertação
Title: Ferramentas moleculares para a caracterização de Colletotrichum spp. associados à antracnose da mandioca
metadata.dc.creator: Silva, Leandro Lopes da
metadata.dc.contributor.advisor1: Oliveira, Saulo Alves S. de
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Bragança, Carlos Augusto Dórea
metadata.dc.contributor.referee1: Oliveira, Saulo Alves Santos de
metadata.dc.contributor.referee2: Oliveira, Thiago Alves Santos de
metadata.dc.contributor.referee3: Matos, Aristóteles Pires de
metadata.dc.description.resumo: A antracnose causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides sensu lato é uma importante doença em diversas culturas, dentre elas a mandioca. Devido a dificuldade de identificação do patógeno por meio de características morfológicas, métodos moleculares vêm sendo utilizados no auxílio de diferenciação e identificação do patógeno. O presente estudo teve por objetivo testar métodos moleculares na diferenciação de linhagens filogenéticas de C. gloeosporioides sensu lato que possam ser utilizados para o direcionamento do sequenciamento. Desta forma, materiais vegetais que apresentavam sintomas da doença foram coletados em 17 cidades pertencentes ao Recôncavo da Bahia para a realização do isolamento e obtenção de culturas monospóricas do patógeno. Folhas sadias de mandioca foram utilizadas para a inoculação do patógeno e teste de patogenicidade. Duas estratégias foram utilizadas, sendo a primeira o agrupamento dos isolados por meio de regiões repetitivas BOX e ERIC; e segunda técnicas baseadas em PCR-RFLP realizadas in silico e in gel. Para a análise das regiões repetitivas, os produtos de PCR foram corridos em gel de agarose 1,5%, seguido de análise das bandas apresentadas. Para a análise dos dados, os padrões de bandas apresentados nos géis foram convertidos em matrizes sendo ‘0’ ausência da banda e ‘1’ presença. As matrizes binárias obtidas foram utilizadas para estimativa de distância genética e construção de dendrogramas. Enquanto que para a técnica de PCR-RFLP, análises in silico foram realizadas para a determinação das regiões gênicas de maior potencial de separação das linhagens filogenéticas do complexo, bem como as melhores combinações de enzimas de restrição a serem utilizadas. Após a escolha da região, foram realizados ensaios in gel (amplificação por PCR e digestão com enzimas de restrição). Os produtos da clivagem foram observados em gel de agarose 2%. Para as regiões repetitivas, o BOX-PCR apresentou um baixo polimorfismo para os isolados testados, enquanto que a amplificação baseada em ERIC-PRC apresentou um maior grau de polimorfismo, e permitiu um melhor agrupamento de indivíduos e separação de algumas linhagens filogenéticas dentro do complexo C. gloeosporioides. O uso conjunto de dados do BOX e ERIC-PCR diminuiu a capacidade discriminatória apresentada somente por ERIC. Em relação à técnica de PCR-RFLP, a combinação (região de interesse + enzima de restrição) que apresentou maior potencial discriminatório das linhagens filogenéticas foi a Calmodulina (CAL), nas análises in silico. Sendo que as enzimas que apresentaram melhor resultado foram AluI, BsuRI, HhaI, HinfI, MspI e TaqI. A validação destas análises in gel permitiu observar os mesmo padrões esperados das análises in silico, inclusive, possibilitanto a utilização de dados “híbridos”, ou seja, estimativa da provável linhagen filogenética dos indivíduos com base no padrão esperado para cada uma das espécies do complexo C. gloeosporioides gerados nas análises in silico, comparando-os com os padrões de banda obtidos nas análises in gel. A utilização de ERIC-PCR e CAL PCR-RFLP na diferenciação de linhagens filogenéticas pertencentes ao complexo C. gloeosporioides mostrou-se eficiente na diferenciação de espécimes, podendo ser utilizada como ferramentas de auxílio na identificação e direcionamento do sequenciamento.
Abstract: Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides sensu lato is an important disease in different cultures, among them cassava. Because the pathogen identification difficulty through morphological characteristics, molecular methods have been used in supporting differentiation and identification of the pathogen. This study was conducted in order to test methods of molecular species differentiation of C. gloeosporioides sensu lato which can be used which can be used prior to sequencing. Plant material with symptoms of the disease were collected in 17 cities belonging to the Recôncavo da Bahia to perform the isolation and obtaining monosporic cultures of the pathogen. Healthy detached cassava leaves were used for inoculation of the pathogen and pathogenicity testing. Two strategies were used, the first based on the grouping of isolated by the repetitive regions BOX and ERIC; and second techniques based on PCR-RFLP performed in silico and in gel. For the analysis of repetitive regions, PCR products were run on 1.5% agarose gel, followed by evaluation of the bands for each isolate. For data analysis, the band patterns shown in the gels have been converted into a matrix with '0' the absence of the band and '1' presence. The obtained binary matrices were used to estimate gnetic distance and to build the dendrograms. Regarding to PCR-RFLP, in silico analyzes were performed for determination of gene regions of greatest potential for separation of species of the complex as well as the best combinations of restriction enzymes to be used. After selecting the region in gel assays were performed (amplified by PCR and digestion with restriction enzymes). The cleavage products were observed in 2% agarose gel. For repetitives regions, the BOX-PCR showed a low polymorphism for the isolate tested, whereas the amplification based on ERIC-CRP showed a greater degree of polymorphism, and allowed a better grouping individuals and separation of some lineages within C. gloeosporioides complex. The combined use of data BOX and ERIC-PCR reduced the discriminatory capacity presented only by ERIC. In relation to PCR-RFLP technique, the combination (region of interest + restriction enzyme) that showed the highest potential discriminatory phylogenetic lineages was Calmodulin (CAL), in the in silico analysis. Given that the enzymes that showed better results were AluI, BsuRI, HhaI, HinfI, MspI and TaqI. The validation of these analyzes in gel allowed to observe the same expected patterns of in silico analysis, including allowing the use of data "hybrid", ie, estimation of probable lineage phylogenetic of individuals based on the expected pattern for each species of the C. gloeosporioides complex generated by in silico analysis, comparing them with the band patterns obtained in the in gel analysis. The use of ERIC-PCR and PCR-RFLP CAL was effective in differentiating phylogenetic lineages belonging to the C. gloeosporioides complex and can be used as a tool in identifying and alternative to sequencing.
Keywords: Rep-PCR
CAL PCR-RFLP
Complexo de espécies
Manihot esculenta Crantz
metadata.dc.subject.cnpq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS
metadata.dc.language: por
metadata.dc.publisher.country: Brasil
Publisher: Universidade Federal do Recôncavo da Bahia
metadata.dc.publisher.initials: UFRB
metadata.dc.publisher.department: Departamento 1
metadata.dc.publisher.program: PPG1
Citation: SILVA, Leandro Lopes da. Ferramentas moleculares para a caracterização de Colletotrichum spp. associados à antracnose da mandioca. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Mestrado em Microbiologia Agrícola, Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das Almas, 2016.
metadata.dc.rights: Acesso Aberto
URI: http://localhost:8080/handle/prefix/1082
Issue Date: 20-Jul-2016
Appears in Collections:CCAAB - Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola (Dissertações)

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